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【文献热点】值得警惕的外显测序 雷区1:基因组的特殊区间局限性(高GC/同源区间)

发布时间 :2021-06-18 13:58 阅读 :

随着高通量测序技术的发展,外显子组测序越来越多地应用于科学研究与临床诊断。但是,外显子组测序依然存在一些局限性,如 GC 含量、捕获效应、变异识别的局限性等因素都可能影响外显子测序的准确性和敏感性,接下来我们将作出一个系列来探讨这些值得警惕的外显子测序雷区,提醒大家不要“踩雷”。

 

雷区1:基因组的特殊区间局限性(高GC/同源区间)

本期,我们分享基因组上的特殊区间,如高GC区间、同源区间,导致的全外显子测序局限性。
 

 

通过评估三个不同的平台(NimbleGen CapSeq V2, Agilent SureSelect V2 和 Illumina TruSeq)生成的 WES 数据中覆盖率,发现全外测序覆盖度不均匀的特点,这种覆盖度的不均匀性既包括局部的(同一外显子在不同平台上的覆盖率不同),也包括全局的(不同测序平台上的所有外显子的覆盖率不同)。低覆盖率或者说覆盖差的区域可能含有重要功能的基因,并且通常与高 GC 含量、重复单元和片段重复相关。虽然与 WES 相关的大多数问题都是由于捕获方法的局限性,但 WES 技术需进一步改进以提高其临床应用 [1]

 

基因组序列中,存在很多用 Sanger 或 NGS 方法难以或无法分析的区域。这些区域的存在证实了整个人类外显子组的高同源性的普遍特征(表1,[2])。

 

表1. NGS “死亡区域”(dead zone)(2.2%的外显子;619个基因): 这些区域是完整的外显子或与其他基因座100% 相同的外显子的大的连续部分; Sanger “死亡区域”(dead zone): 外显子组中不能使用标准短扩增子的方法进行 Sanger 测序的区域。

 

对于某些高度同源的区域,WES 检测存在很大的局限性,例如 ADPKD,WES 在检测 PKD1 外显子1-32 突变时,该特异区域的检测灵敏度仅为7.14%。通过评估WES、WGS 和靶向富集法检测 PKD1 和 PKD2 基因 ADPKD 突变的有效性,结果显示与 WGS 和靶富集阵列相比,在 ADPKD 患者中,WES 检测到 PKD1 突变的敏感性为50%,WES 检测到 PKD1 重复区域(外显子1-32)的测序深度和测序质量较低[3]

 

另一个典型的同源区域影响 NGS 检测与分析的案例是编码β型微管蛋白的基因 TUBB2A。微管蛋白(tublins)和微管聚合物,通过影响细胞增殖、神经元迁移和迁移后发育,在哺乳动物大脑皮层发育过程中发挥关键作用。β型微管蛋白基因 TUBB2A 变异导致婴儿期癫痫伴简化脑回,文献中提及 WES 数据初次判读并未找到致病变异,后经重分析才获取变异信息。这是由于该变异所在序列高度保守,对应的氨基酸残基形成的肽环(T7环)在 α 和 β 微管蛋白家族中高度保守(图1, [4])。

 

图1:T7环(框内)是高度保守的,不仅在β微管蛋白同型之间,而且在整个 α 和 β 微管蛋白家族(保守的残基用星号表示)。

 

目前的 NGS 属于短读长测序,且依赖于 PCR 反应过程。高 GC 含量的区域不易扩增,导致覆盖度低,通过优化实验过程和提高测序深度等方法可以在一定程度上改观。同源序列的存在无疑会为组装过程和读取变异带来困难,在对外显子进行测序时,要格外重视基因组中同源序列的影响,必要时采取其他技术手段,例如采用长片段 PCR 结合 NGS 的方法(LR-PCR+NGS)进行检测。后者已经在 ADPKD 或 21-OHD 等同源基因检测中获得成熟应用。

 

参考文献:

[1]  Wang Q, Shashikant CS, Jensen M, Altman NS, Girirajan S. Novel metrics to measure coverage in whole exome sequencing datasets reveal local and global non-uniformity. Sci Rep. 2017 Apr 13;7(1):885. 

[2]  Gotway G, Crossley E, Kozlitina J, Xing C, Fan J, Hornbuckle C, Thies J, Michel D, Quinn C, Scheuerle AE, Umana LA, Uhles CL, Park JY. Clinical Exome Studies Have Inconsistent Coverage. Clin Chem. 2020 Jan 1;66(1):199-206.  

[3]  Ali H, Al-Mulla F, Hussain N, Naim M, Asbeutah AM, AlSahow A, Abu-Farha M, Abubaker J, Al Madhoun A, Ahmad S, Harris PC. PKD1 Duplicated regions limit clinical Utility of Whole Exome Sequencing for Genetic Diagnosis of Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease. Sci Rep. 2019 Mar 11;9(1):4141.

[4]  Cushion TD, Paciorkowski AR, Pilz DT, Mullins JG, Seltzer LE, Marion RW, Tuttle E, Ghoneim D, Christian SL, Chung SK, Rees MI, Dobyns WB. De novo mutations in the beta-tubulin gene TUBB2A cause simplified gyral patterning and infantile-onset epilepsy. Am J Hum Genet. 2014 Apr 3;94(4):634-41.