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【文献热点】值得警惕的外显测序雷区2:NGS/外显测序的技术局限性(测序深度/覆盖率)

发布时间 :2021-06-25 13:41 阅读 :

雷区2:NGS/外显技术局限性(覆盖深度/覆盖率)

不同的测序平台之间的数据质量存在差异。相关研究对比了Complete Genomics和Illumina HiSeq全基因组和全外显子组测序的错误率下限边界。根据平台和测序深度的不同,非参考序列的基因型检测错误率从0.1%到0.6%不等。Complete Genomics测序平台的数据错误率明显高于Illumina测序平台,尤其是对于某些罕见或特殊的变异,其错误率更高(高达6%),而Illumina错误率随着数据测序深度的增加而减少,因此我们在解读下一代测序(NGS)相关检测结果时应更加谨慎,尤其是在没有其他更可靠的测序或基因分型方法验证的情况下,在临床应用该技术时更是如此[1]

 

除此之外,外显子测序对于某些疾病的诊断也存在局限性,如庞贝病。相关研究分析了93例确诊庞贝病患者的WES数据以及通过PCR/ Sanger测序分析了GAA的基因型,对患者基因型和表型及全外显检测结果一致性进行评估。通过WES检测使用标准生物信息学方法分析,在42/93(45%)的患者中检测到了GAA基因的两个致病性变异;但是在42/93(45%)的患者中一个GAA致病性变异(GAA内含子c.-32-13T>G)被遗漏并且在9/93(10%)的患者中未发现GAA致病性变异[c.1195-19_2190-17del(p.Asp399fs*6)以及18号外显子缺失](表1,[2])。

 

表1  经标准 WES 分析流程漏掉的突变

 

同样,在对一个由近亲生育的3名非综合征性听力障碍儿童的家庭的研究中,GIPC3基因的c.508C>A(p.H170N)和 ZNF57 的 c.1328C>T(p.T443M)的双基因组错义纯合变异可导致常染色体隐性非综合征型感音神经性耳聋。但由于测序深度不够深,GIPC3中一种新的错义突变在分析过程中最初被过滤掉导致出的结论是ZNF57是唯一的潜在致病基因(表2,[3])。

 

表2  单倍型谱系,听力敏度图以及检出的两个变异.(A)与表型共分离的家系和19号染色体上第三长的自系纯合(autozygous)区域;(B)家庭中受累成员的听力图;(C)ZNF57 (p.T443M)的野生型、纯合子型和杂合子型Sanger 测序图;(D)GIPC3 (p.H170N) 的野生型、纯合子型和杂合子型 Sanger 测序图

 

因此,对于WES检测,我们需要注意到WES虽然能够对基因的外显子区域进行测序,但是这种检测手段仍然存在局限性。使用外显子组测序进行临床诊断时需要认识到普遍存在的基因片段缺失/重复或内含子的致病性变异,以及外显子组测序在临床相关基因组位置的测序深度和覆盖率不足的可能性,而这些可能会导致全外显子组测序结果假阴性[4]。提高测序深度到200x以上可以显著降低局限性和提高检出率。

 

 

参考文献:

[1] Wall Jeffrey D,Tang Ling Fung,Zerbe Brandon et al. Estimating genotype error rates from high-coverage next-generation sequence data.[J] .Genome Res, 2014, 24: 1734-9.

[2] Mori Mari,Haskell Gloria,Kazi Zoheb et al. Sensitivity of whole exome sequencing in detecting infantile- and late-onset Pompe disease.[J] .Mol Genet Metab, 2017, 122: 189-197.

[3] Sirmaci Asli,Edwards Yvonne J K,Akay Hatice et al. Challenges in whole exome sequencing: an example from hereditary deafness.[J] .PLoS One, 2012, 7: e32000.

[4] Gotway Garrett,Crossley Eric,Kozlitina Julia et al. Clinical Exome Studies Have Inconsistent Coverage.[J] .Clin Chem, 2020, 66: 199-206.