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【文献热点】值得警惕的外显测序雷区4:变异类型识别局限性(嵌合体/单外显CNV/大Indel/ Alu

发布时间 :2021-07-09 13:02 阅读 :
雷区4:变异类型识别局限性(嵌合体/单外显CNV/大Indel/ Alu 插入变异)

1、嵌合体的识别

与特定临床表型相关的嵌合体变异很容易识别,但是当缺乏明显的特异性表型,尤其是患者的临床表现与该基因非嵌合情况下的临床表现有较大差异时,识别潜在的嵌合体变异是一个很大的临床挑战。一项研究[1]对不同系统、不同适应症的患者(总计12,000例样本)的外显子测序(ES)结果进行统计后发现,约1.5%的先证者存在与表型相关的致病性嵌合体变异,0.3%的亲代样本中存在与先证者表型相关的嵌合体突变。在常规的ES中,捕获芯片更加侧重于覆盖基因的广度而不是测序的深度,如果没有额外的验证实验,可能会遗漏潜在的嵌合体变异。

图1 队列SNV检测选择策略

2、单外显CNV

外显子测序准确检测 CNV 的能力对于基因诊断和对基因功能研究都至关重要,而检测外显子水平,特别是单个外显子,需要更深测序深度,同时要最大限度地减少假阳性而同时识别所有的真阳性,这无疑是一个巨大的技术挑战。同时需要依靠快速准确识别CNV 的算法,以提高单个外显子检测的特异性和灵敏度[2]

 

一项研究[3]对3010份临床上进行外显子测序的案例进行了数据重分析,样本平均测序深度为123.3X,在临床相关的 CNV 水平上,总体灵敏度为98.7%,尽管如此,依然未能检测到单个外显子的小的 CNV。这个问题的解决需要用更高的测序深度以达到更小的 CNV 分辨率,同时需要保证目标区域有较好的探针覆盖度。

 

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图2 研究的分析流程

 

3、大 Indel

外显子测序能够轻松检测SNV和小插入缺失(Indel)。然而,涉及外显子缺失/重复和染色体重排的基因组变化需要对捕获的 NGS 数据进行更仔细的分析,因为当 Indel的大小接近或大于NGS 读长时,NGS读取可能无法正确对齐参考序列。对捕获区域的富集以及深度测序能够避免由于 PCR 引物或二级 DNA 结构中的 SNP 导致的等位基因丢失,以达到同时检测点突变和基因内外显子缺失的能力[4]

 

4、Alu插入变异

基于捕获区域的富集和高深度测序,能识别目标基因中大量的缺失和插入,一项研究[5]中使用平均测序深度为1000x的捕获测序,用于无关的视网膜色素变性(RP)患者的临床分子诊断,能够识别靶基因中的外显子缺失和插入,诊断率高达82%(53/65),其中包括了Alu序列的插入和深度内含子变异。如此高诊断率的结果,源于全面的目标区域覆盖、高深度测序、外显子水平覆盖均一性以及100%的灵敏度和特异性[5]
 
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图3 9个随机选择的样本中平均覆盖率与覆盖率低于20倍的CDS数量之间的关系测序深度的提高对于减少未充分覆盖区域数量以及提高变异调用的准确性至关重要)

 

但基于捕获的外显子测序依然有其局限性,通常在具有高GC含量的外显子或具有重复序列的区域或基因组其他部分具有高度同源序列的区域中具有低覆盖率。因此,为了实现这些区域的100%覆盖,需要PCR或Sanger验证。

 

参考文献:

[1] Cao Y, Tokita MJ, Chen ES, Ghosh R, Chen T, Feng Y, Gorman E, Gibellini F, Ward PA, Braxton A, Wang X, Meng L, Xiao R, Bi W, Xia F, Eng CM, Yang Y, Gambin T, Shaw C, Liu P, Stankiewicz P. A clinical survey of mosaic single nucleotide variants in disease-causing genes detected by exome sequencing. Genome Med. 2019 Jul 26;11(1):48. doi: 10.1186/s13073-019-0658-2. PMID: 31349857; PMCID: PMC6660700.

[2] Chiang T, Liu X, Wu TJ, Hu J, Sedlazeck FJ, White S, Schaid D, Andrade M, Jarvik GP, Crosslin D, Stanaway I, Carrell DS, Connolly JJ, Hakonarson H, Groopman EE, Gharavi AG, Fedotov A, Bi W, Leduc MS, Murdock DR, Jiang Y, Meng L, Eng CM, Wen S, Yang Y, Muzny DM, Boerwinkle E, Salerno W, Venner E, Gibbs RA. Atlas-CNV: a validated approach to call single-exon CNVs in the eMERGESeq gene panel. Genet Med. 2019 Sep;21(9):2135-2144. doi: 10.1038/s41436-019-0475-4. Epub 2019 Mar 20. PMID: 30890783; PMCID: PMC6752313.

[3] Sun Y, Ye X, Fan Y, Wang L, Luo X, Liu H, Gao X, Gong Z, Wang Y, Qiu W, Zhang H, Han L, Liang L, Ye H, Xiao B, Gu X, Yu Y. High Detection Rate of Copy Number Variations Using Capture Sequencing Data: A Retrospective Study. Clin Chem. 2020 Mar 1;66(3):455-462. doi: 10.1093/clinchem/hvz033. PMID: 32031585.

[4] Wang J, Yu H, Zhang VW, Tian X, Feng Y, Wang G, Gorman E, Wang H, Lutz RE, Schmitt ES, Peacock S, Wong LJ. Capture-based high-coverage NGS: a powerful tool to uncover a wide spectrum of mutation types. Genet Med. 2016 May;18(5):513-21. doi: 10.1038/gim.2015.121. Epub 2015 Sep 24. PMID: 26402642.

[5] Wang J, Zhang VW, Feng Y, Tian X, Li FY, Truong C, Wang G, Chiang PW, Lewis RA, Wong LJ. Dependable and efficient clinical utility of target capture-based deep sequencing in molecular diagnosis of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014 Aug 5;55(10):6213-23. doi: 10.1167/iovs.14-14936. PMID: 25097241.